Механизмы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ)

© Москвин Сергей Владимирович – доктор биологических наук, кандидат технических наук, профессор курса реабилитационной медицины Академии постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, г. Москва, автор более 550 научных публикаций, в том числе более 50 монографий, и 35 авторских свидетельств и патентов; эл. почта: 7652612@mail.ru, сайт: www.lazmik.ru 

В фотобиологии, рассматривающей специфическое действие света — фотохимические реакции, фотосинтез и др., изучаются процессы взаимодействия пары акцептор-фотон, обеспечивающей фотобиологический эффект. Для каждого фотоиндуцированного процесса необходимо найти свой акцептор (поглотитель) фотонов света с заданной энергией или, иначе, излучение с определенной длиной волны.
Однако автоматический перенос «акцепторной» модели на исследование биологического действия НИЛИ не может удовлетворительно объяснить уже имеющиеся экспериментальные и клинические данные. Возможно, к рассмотрению данного вопроса необходимо подойти с принципиально других позиций, в том числе и в методологическом плане. Пусковой механизм индуцированных НИЛИ биологических реакций, похоже, единый, универсальный, и обусловлен, скорее всего, универсальностью механизмов поддержания гомеостаза.
Дальнейшее развитие лазерной терапии настоятельно требует рассматривать НИЛИ как внешний фактор, обеспечивающий всего лишь запуск физиологических реакций, т. е. необходимо исследовать биологические эффекты с позиций динамического взаимодействия НИЛИ — биологический объект.
Основная сложность, стоящая перед исследователями механизмов терапевтического действия НИЛИ, заключается в многообразии процессов, происходящих в живых тканях и организмах. Еще больше проблем вызывает изучение межклеточных взаимодействий и физиологических процессов на органном уровне. В настоящее время исследованы только некоторые локальные участки регуляции биологических процессов и совсем мало обнаружено общих закономерностей.
Накоплен колоссальный объем научных данных о характере частных примеров ответных реакций различных биологических структур на возмущение, вызванное лазерным излучением. Необходимо проанализировать результаты научных исследований в плане обобщения разрозненных данных, и не только под иным углом зрения взглянуть на проблему механизмов биологического действия НИЛИ, но, самое главное, обосновать максимально эффективные параметры терапевтического воздействия лазерным излучением.
Первым обращает на себя внимание тот факт, что эффект от действия НИЛИ вызывает только оптимальная доза воздействия. При уменьшении или увеличении дозы в достаточно узком диапазоне эффект уменьшается или отсутствует вовсе. В этом принципиальное отличие действия НИЛИ от фотобиологических явлений, где зависимость от дозы носит нарастающий в широких пределах характер. Например, чем больше солнечного света, тем интенсивнее фотосинтез и больше растительной массы.
Другой, удивительный, на первый взгляд факт, — отсутствие так называемого, спектра действия, т. е. специфической зависимости биологического действия НИЛИ от длины волны падающего света. Эффекты проявляются во всем исследованном спектральном диапазоне от 0,337 мкм до 10,6 мкм. Это кажется, на первый взгляд, странным, т. к. каждый акцептор в биологической структуре имеет достаточно узкую полосу поглощения (спектр действия) и излучение с другой длиной волны не может вызвать фотобиологической реакции. Так что же в нашем случае является акцептором?
Эти и другие данные, например, зависимость эффекта от частоты модуляции, когерентности, поляризации и т. д. — вынуждают рассматривать данное явление совсем не как фотобиологическую реакцию.
Однако разобраться именно с первичными механизмами биологического действия НИЛИ принципиально важно, т. к. заблуждение на начальном этапе приведет (и приводит сейчас!) к неправильным выводам уже в клинической практике. Отсутствие убедительной теоретической основы не позволяет развивать лазерную терапию, прогнозировать результат воздействия, разрабатывать наиболее эффективные методики лечения.
Так как же на самом деле развиваются индуцированные НИЛИ биологические процессы? Можно ли проследить всю цепочку от первичного акта поглощения до выздоровления пациента? Можно ли полно и достоверно объяснить имеющиеся научные факты и на их основе разрабатывать максимально эффективные методики лечения? На наш взгляд, есть все основания для утвердительного ответа на эти вопросы.
Механизмы биологического (терапевтического) действия НИЛИ на организм необходимо рассматривать только с позиции общности природы, как воздействующего излучения, так и организации живой материи. На рис. представлена схематично практически вся последовательность реакций, начиная от первичного акта поглощения фотона и заканчивая реакцией различных систем организма. Данная схема может быть дополнена деталями патогенеза конкретного заболевания.
С чего все начинается? Представленные выше факты и полученные T.I. Karu с соавт. (1994) данные убедительно доказывают, что подобные эффекты могут быть вызваны только термодинамическими нарушениями при поглощении лазерного (когерентного, монохроматичного и поляризованного) излучения внутриклеточными компонентами. Теоретические оценки показывают, что при воздействии лазерным излучением возможен локальный нагрев акцепторов на десятки градусов. Хотя процесс длится очень короткий промежуток времени — около 10-12 с, — этого вполне достаточно для весьма значительных термодинамических изменений как в группе хромофоров непосредственно, так и в окружающих областях, что приводит к существенным изменениям свойств молекул, и является пусковым моментом индуцированной лазерным излучением реакции. Подчеркнем еще раз, что в качестве акцептора может выступать любой внутриклеточный компонент, имеющий полосу поглощения для данной длины волны. Т. е. начальным пусковым моментом биологического действия НИЛИ является не фотобиологическая реакция как таковая, а локальный нагрев. Это принципиально важный момент.
При незначительных локальных возмущениях, недостаточных для перевода молекулы в новое конформационное состояние, может сравнительно сильно измениться геометрия, конфигурация молекул. Структуру молекулы как бы «ведет», чему способствует возможность поворотов вокруг одинарных связей главной цепи, не очень строгие требования, предъявляемые к линейности водородных связей, и т. д. Это свойство макромолекул может решительным образом влиять на их функционирование. Для эффективного преобразования энергии достаточно возбуждать такие степени свободы системы, которые медленно обмениваются энергией с тепловыми степенями свободы. Предположительно, способность к направленным конформационным изменениям, т. е. к механическому движению под действием локальных возмущений, есть отличительная особенность белковых макромолекул, и требуемые релаксационные изменения вполне могут быть индуцированы лазерным излучением низкой, «терапевтической» интенсивности [Гудвин Б., 1966; Москвин С.В., 2003, 2008].
Становится понятным, почему эффект достигается при воздействии именно лазерным излучением и наиболее важным является такое его свойство как монохроматичность или малая ширина спектральной линии. Если она будет сравнима с полосой поглощения макромолекулы (30 нм и более), то такое излучение вызовет колебание всех энергетических уровней и произойдет лишь слабый, на доли градусов, нагрев всей молекулы. Тогда как узкий спектр, характерный для лазерного излучения (менее 3 нм) вызовет так необходимый нам для эффекта локальный нагрев уже на десятки градусов, когда вся энергия лазера будет выделяться на небольшом локальном участке макромолекулы, вызывая термодинамические изменения, достаточные для запуска дальнейшего физиологического отклика. Проводя условную, но вполне наглядную аналогию, процесс можно представить так, — при концентрации увеличительным стеклом солнечного света на точку можно поджечь бумагу, тогда как при освещении рассеянным светом всей ее поверхности, ничего не происходит.
Следствием фотоиндуцированного «поведения» макромолекул является высвобождение ионов кальция из кальциевого депо. При этом увеличивается концентрация Са2+ в цитозоле (свободной части воды) [Смольянинова Н.К. и др., 1990; Alexandratou E. et al., 2002]. Во всех исследованиях эти изменения отмечались лишь в совокупности с другими процессами, не выделяя это явление каким-то образом, и только нами впервые было высказано предположение, что увеличение концентрации Са2+ в цитозоле является именно основным механизмом, запускающем лазериндуцированные процессы, а также замечено, что все физиологические изменения происходящие вследствие этого на самых различных уровнях, — кальцийзависимые [Москвин С.В., 2003].
Почему мы обращаем внимание именно на ионы кальция? Причин этому несколько.

• Кальций в наибольшей степени находится в специфически и неспецифически связанном состоянии, как в клетках (99,9%), так и в крови (70%) [Марри Р. и др., 1993]. Т. е. принципиально существует возможность значительного увеличения концентрации свободных ионов кальция, и этот процесс действительно обеспечивается не одним десятком механизмов.
• Необычайная универсальность действия Ca2+ на всех уровнях регулирования многочисленных физиологических процессов.
• Внутриклеточная концентрация Са2+ чрезвычайно мала — 0,1-10 мкм/л, поэтому высвобождение даже небольшого абсолютного количества этих ионов из связанного состояния, приводит к существенному относительному повышению концентрации Ca2+ в цитозоле [Смольянинова Н.К. и др., 1990; Alexandratou E. et al., 2003].
• Ca2+-индуцированное изменение митохондриального мембранного потенциала и увеличение внутриклеточного pH, приводит к увеличению продукции АТФ и в конечном итоге стимулирует пролиферацию [Кару Т.Й., 2000; Schaffer M. et al., 1997]. Стимуляция видимым светом приводит к повышению уровня внутриклеточного цАМФ, практически синхронно с изменением концентрации внутриклеточного Ca2+, в первые минуты после воздействия [Daniolos A. et al., 1990], способствуя, таким образом, регуляции, осуществляемой кальциевыми насосами.
• Также задействуется и другой механизм, через Са2+-связывающие белки: кальбиндин, кальретинин, парвальбумин и эффекторы, такие как тропонин С, СаМ, синаптотагмин, белки S100 и аннексины, которые отвечают за активацию различных Са2+-чувствительных процессов в клетках [John L.M. et al., 2001; Palecek J. et al., 1999].
• Наличие различных колебательных контуров тесно связано с динамикой высвобождения и регулирования уровня кальция. Дело в том, что локальное повышение концентрации Ca2+ не заканчивается равномерной диффузией ионов в цитозоле или включением механизмов закачивания излишков кальция во внутриклеточные депо, а сопровождается распространением волны повышенной концентрации Ca2+внутри клетки, и вызывающей многочисленные кальцийзависимые процессы [Alexandratou E. et al., 2003; Tsien R.Y., Poenie M., 1986]. Ионы кальция, высвобождаемые одним кластером специализированных канальцев, диффундируют к соседним и активируют их. Этот механизм скачкообразного распространения позволяет начальному местному сигналу запустить глобальные волны и колебания концентраций Са2+ [Berridge M.J. et al., 2000].
• В некоторых случаях волны Ca2+ очень ограниченны в пространстве, например, в амакриновых клетках сетчатки, в которых местные сигналы с дендритов используются для расчета направления движения [Euler Т. et al., 2002]. Вдобавок к таким внутриклеточным волнам, информация может распространяться от клетки к клетке посредством межклеточных волн, как это было описано для эндокринных клеток [Fauquier T. et al., 2001], гаструлы позвоночных [Wallingford J.В. et al., 2001] и для интактной перфузируемой печени [Robb-Gaspers L.D., Thomas A.P., 1995]. В некоторых случаях межклеточные волны могут переходить с одного типа клеток на другие, как это бывает в случае эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры [Yashiro Y., Duling B.R., 2000].

Что происходит после того, как волны повышенной концентрации Ca2+ стали распространяться под влиянием НИЛИ в цитозоле клетки и между группы клеток?
Использование НИЛИ получило широкое распространение в различных областях медицины именно благодаря тому, что немногочисленные универсальные по своей природе первичные фотобиологические реакции вызывают самые разнообразные биохимические и физиологические реакции в организме. Вторичные эффекты представляют собой комплекс адаптационных и компенсационных реакций, возникающих в результате реализации первичных эффектов в тканях, органах и целостном живом организме, и направленных на его восстановление:

• активизацию метаболизма клеток и повышение их функциональной активности;
• стимуляцию репаративных процессов;
• противовоспалительное действие;
• активизацию микроциркуляции крови и повышение уровня трофического обеспечения тканей;
• аналгезирующее действие;
• иммуностимулирующее действие;
• рефлексогенное действие на функциональную активность различных органов и систем.

Все эти процессы — кальцийзависимые! Рассмотрим, как именно происходят представленные физиологические изменения.
Активизация метаболизма клеток и повышение их функциональной активности происходит в первую очередь, вследствие кальцийзависимого повышения редокс-потенциала митохондрий, их функциональной активности и синтеза АТФ [Кару Т.Й., 2000; Filippin L. et al., 2003; Schaffer M. et al., 1997].

Стимуляция репаративных процессов зависит от Ca2+ на самых различных уровнях. Кроме активизации работы митохондрий при повышении концентрации свободного внутриклеточного кальция активируются протеинкиназы, принимающие участие в образовании мРНК [Watman N.P. et al., 1988]. Также ионы кальция являются аллостерическими ингибиторами мембрансвязанной тиоредоксинредуктазы, фермента, контролирующего сложный процесс синтеза пуриновых дизоксирибонуклеотидов в период активного синтеза ДНК и деления клеток [Родуэлл В., 1993]. В физиологии раневого процесса, кроме того, активно участвует основной фактор роста фибробластов (bFGF), синтез которого и активность зависят от концентрации Ca2+ [Abdel-Naser M.B., 1999].

Противовоспалительное действие НИЛИ и его влияние на микроциркуляцию обусловлено в частности кальцийзависимым высвобождением медиаторов воспаления, таких как цитокины [Uhlen P. et al., 2000], или также кальцийзависимым выделением клетками эндотелия оксида азота (NO) — предшественника фактора расслабления стенок кровеносных сосудов (EDRF) [Murrey R.K. et al., 1996].

Поскольку кальцийзависимым является экзоцитоз [Carafoli E., et al., 2001], в частности, высвобождение нейромедиаторов из синаптических везикул [Palecek J., et al., 1999], то процесс нейрогуморальной регуляции полностью контролируется концентрацией Ca2+, а, следовательно, подвержен и влиянию НИЛИ. Кроме того, известно, что Ca2+ является внутриклеточным посредником действия ряда гормонов, в первую очередь медиаторов ЦНС и ВНС [Греннер Д., 1993], что также предполагает участие эффектов, вызванных лазерным излучением в нейрогуморальной регуляции.

Взаимодействие нейроэндокринной и иммунной систем не изучено в достаточной степени, но установлено, что цитокины, в частно­сти ИЛ-1 и ИЛ-6, действуют в обоих направлени­ях, играя роль модуляторов взаимодействия этих двух систем [Ройт А. и др., 2000]. НИЛИ может влиять на иммунитет как опосредованно через нейроэндокринную регуляцию, так и непосредственно, через иммунокомпетентные клетки (что доказано в экспериментах invitro). К числу ранних пусковых моментов бласттрансформации лимфоцитов отно­сится кратковременное повышение концентрации свободного внутриклеточного кальция, который активирует протеинкиназу, принимающую участие в образовании мРНК в Т-лимфоцитах [Watman N.P. et al., 1988], что в свою очередь, является ключевым моментом лазерной стимуляции Т-лимфоцитов [Мантейфель В.М., Кару Т.Й., 1999]. Воздействие НИЛИ на клетки фибробластов invitro приводит также к повышенной генерации внутриклеточного эндогенного γ-интерферона [Adachi Y. et al., 1999; Rosenspire A.J. et al., 2000].
Теперь, когда перед нами представлена полная картина механизмов действия НИЛИ, попробуем получить ответ на некоторые вопросы.

Например, чем объяснить дозозависимый характер эффектов? При увеличении дозы растет и локальная температура, что вызывает высвобождение Ca2+, но как только количество ионов кальция в цитозоле начинает превышать определенный уровень, включаются механизмы закачивания Ca2+ в кальциевые депо и эффект исчезает.
Почему в импульсном режиме эффект выше, при дозах, в 100-1000 раз меньших? Потому что время термодинамической релаксации макромолекул (10-12 с) значительно меньше длительности импульса (10-7 с) и очень короткий, в нашем понимании, импульс мощностью в ватты оказывает большее влияние на локальное термодинамическое равновесие, чем непрерывное излучение в единицы милливатт.
Таким образом, мы полагаем, что в биологических эффектах НИЛИ в качестве первичного действующего фактора выступают локальные термодинамические нарушения, вызывающие цепь изменений кальцийзависимых физиологических реакций организма. Причем направленность этих реакций может быть различна, что определяется дозой и локализацией воздействия, а также исходным состоянием самого организма.
Разработанная нами теория позволяет не только объяснить уже имеющиеся факты, но на ее основе можно делать выводы, как о прогнозировании результатов влияния НИЛИ на физиологические процессы, так и о возможности повышении эффективности лазерной терапии.

Рис. Последовательность развития биологических эффектов от лазерного воздействия

Литература

• Греннер Д. Действие гормонов // Биохимия человека / Под. ред. Р. Марри и др. Т.2. — М.: Мир, 1993. — С.158-169.
• Гудвин Б. Временная организация клетки. — М.: Мир, 1966. — 251 с.
• Кару Т.Й. Первичные и вторичные клеточные механизмы лазерной терапии // Низкоинтенсивная лазерная терапия / Под ред. С.В. Москвина и В.А. Буйлина. — М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. — С.71-94.
• Мантейфель В.М., Кару Т.Й. Излучение He-Ne лазера действует на Т- и не действует на В-лимфоциты. Цитофлуориметрический анализ хроматина // Докл. Акад. наук. — 1999, Том.365, №2. — С.267-269.
• Марри Р., Гренер Д., Мейес П. и др., Биохимия человека: в 2-х томах. — М.: Мир, 1993. — Т. 1-2.
• Москвин С.В. Лазерная терапия в дерматологии: витилиго. — М.: НПЛЦ «Техника», 2003. — 125 с.
  Москвин С.В. Системный анализ эффективности управления биологическими системами низкоэнергетическим лазерным излучением: Автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. - Тула, 2008. - 38 с.
• Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. — М.: Мир, 2000. — 592 с.
• Смольянинова Н.К., Кару Т.Й., Зеленин А.В. Облучение He-Ne лазером усиливает бласттрансформацию, вызванную фитогемагглютинином // Докл. Акад. наук СССР. — 1990. — Т.315, № 5. — С.1256-1259.
• Adachi Y., Kindzelskii A.L., Ohno N. et al. Amplitude and frequency modulation of metabolic signals in Leukocytes: Synergistic role of IFN-? in IL6- and IL-2-mediated cell activation // J. Immunol. — 1999, 163, 4367—4374.
• Alexandratou E., Yova D., Handris P. et al. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy // Photochemical & Photobiological Sciences. — 2003, 1 (8). — P.547-552.
• Berridge M.J., Lipp P., Bootman M.D. The versatility and universality of calcium signalling. — Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
• Carafoli E., Santella L., Brance D., Brisi M. Generation, control, and processing of cellular calcium signals. — Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 36, 107-260 (2001).
• Daniolos A., Lerner A.B., Lerner M.R. Action of light on frog pigment cells in culture // Pigment Cell Res. — 1990, Vol.3, №1. — P.38-43.
• Euler Т., Detwiler P.B., Denk W. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. — Nature 418, 845-852 (2002).
• Fauquier T., Guerineau N.C., McKinney R.A. et al. Folliculostellate cell network: A route for long-distance communication in the anterior pituitary. — Proc. NatlAcad. Sci. USA 98, 8891-8896 (2001).
• Filippin L., Magalhaes P.J., Di Benedetto G. et al. Stable interactions between mitochondria and endoplasmic reticulum allow rapid accumulation of calcium in a subpopulation of mitochondria // J Biol Chem. — 2003; 10.1074.
• John L.M., Mosquera-Caro M., Camacho P., Lechleiter J.D. Control of IP3-mediated Ca2+ puffs in Xenopus laevis oocytes by the Ca2+-binding protein parvalbumin. — J. Physiol. (Lond.) 535, 3-16 (2001).
• Karu T.I. Photobiology of Low-Power Laser Therapy. — London, Paris, New-York: Harwood Acad. Publishers, 1989. — 187 p.
• Karu T., Tiphlova O., Esenaliev R. et al. Two different mechanisms of low-intensity laser photobiological effect on Escherichia coli // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1994, Vol.24. — P.155-161.
• Murrey R.K. et al. Harper’s Biochemistry. — Appleton & Lange, 1996. - 700 p.
• Palecek J., Lips M.B., Keller B.U. Calcium dynamics and buffering in motoneurones of the mouse spinal cord. — J. Physiol. (Lond.)520, 485-502 (1999).
• Robb-Gaspers L.D., Thomas A.P. Coordination of Ca2+ signaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver. — J. Biol. Chem. 270, 8102-8107 (1995).
• Rosenspire A.J., Kindzelskii A.L., Petty H.R. Interferon-? and sinusoidal electric fields signal by modulating NAD(P)H oscillations in polarized neutrophils // Biophys. J. — 2000, 79, 3001—3008.
• Schaffer M., Sroka R., Fuchs C. et al. Biomodulative effects induced by 805 nm laser light irradiation of normal and tumor cells // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. — 1997, Vol.40(3). — P.253-257.
• Tsien R.Y., Poenie M. Fluorescence ratio imaging: a new window into intracellular ionic signaling // TIBS. — 1986. — Vol. 11 (11). — P.450-455.
• Uhlen P. et al. a-Haemolysin of uropathogenic E. coll induces Ca2+ oscillations in renal epithelial cells. — Nature, 277, 694-697 (2000).
• Wallingford J.В., Ewald A.J., Harland R.M., Fraser S.E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. — Curr. Biol. 11. 652-661 (2001).
• Watman N.P., Crespo L., Davis B. et al. Differential effect on fresh and cultured T cells of PHA-induced changes in free cytoplasmic calcium: relation to IL-2 receptor expression, IL-2 production, and proliferation // Cellular Immun. — 1988, Vol.111, №1. — P.158-166.
• Yashiro Y., Duling B.R. Integrated Ca2+ signaling between smooth muscle and endothelium of resistance vessels. — Circ. Res. 87, 1048-1054 (2000).